Kooperative mikrobielle Interaktionen fördern die räumliche Segregation in porösen Umgebungen

Jul 11, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4226 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Rolle mikrobieller Interaktionen und die zugrunde liegenden Mechanismen, die komplexe Biofilmgemeinschaften bilden, sind kaum verstanden. Hier verwenden wir einen mikrofluidischen Chip, um poröse Untergrundumgebungen darzustellen und zu zeigen, dass kooperative mikrobielle Interaktionen zwischen frei lebenden und biofilmbildenden Bakterien eine aktive räumliche Segregation auslösen, um ihre jeweilige Dominanz in getrennten Mikrohabitaten zu fördern. Während der anfänglichen Besiedlung werden frei lebende und biofilmbildende Mikroben aus dem gemischten Plankton-Inokulum abgetrennt, um die Umgebungsflüssigkeit und die Kornoberfläche zu besetzen. Im Gegensatz zur räumlichen Ausgrenzung durch Konkurrenz wird die aktive räumliche Segregation durch kooperative Interaktionen induziert, was die Fitness sowohl von Biofilm- als auch von Planktonpopulationen verbessert. Wir zeigen außerdem, dass frei lebende Arthrobacter die Oberflächenbesiedlung induzieren, indem sie den Biofilminhibitor D-Aminosäuren abfangen und von den öffentlichen Gütern profitieren, die von den biofilmbildenden Stämmen abgesondert werden. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, wie kooperative mikrobielle Interaktionen zur mikrobiellen Koexistenz in getrennten Mikrohabitaten beitragen und die Nachfolge von Biofilmgemeinschaften unter der Oberfläche vorantreiben können.

Der terrestrische und ozeanische Untergrund beherbergt über 80 % der Mikroorganismen auf der Erde und ist somit der wichtigste mikrobielle Lebensraum auf unserem Planeten1,2. Im Gegensatz zu wässrigen Umgebungen (z. B. offenem Ozean), in denen Mikroben größtenteils frei leben (planktonisch), bietet der Untergrund eine immens große Oberfläche für die Anlagerung von Mikroben. Die an der Oberfläche haftenden Mikroben binden Nährstoffe aus dem Porenwasser und wachsen zu dichten Ansammlungen mehrerer Arten, sogenannten Biofilmen3,4. Die unmittelbare Nähe verschiedener Arten in Biofilmen ermöglicht verschiedene Interaktionen zwischen ihnen, wie z. B. Quorum Sensing und synergistischer Stoffwechsel, die die Merkmale und Funktionen der Gemeinschaft bestimmen5,6,7.

In den letzten Jahrzehnten wurden theoretische und experimentelle Forschungen durchgeführt, um die komplexen Wechselwirkungen zu analysieren, die die Struktur der Biofilmgemeinschaft unter der Oberfläche bestimmen. Es wurde festgestellt, dass kooperative Mikroorganismen wie Kreuzungspartner sich in Biofilmgemeinschaften zusammenschließen, um gegenseitige Vorteile zu ermöglichen8,9,10. Im Gegensatz dazu tendieren die einander antagonistischen Mikroorganismen dazu, sich gegenseitig aus lokalen Nischen auszuschließen und sich räumlich zu trennen7,11. Neben direkten funktionellen Konsequenzen kann die physikalische Struktur unterirdischer Umgebungen die ökologische Stabilität und funktionelle Aktivitäten bestimmen, indem sie die räumliche Verteilung kooperativer und konkurrierender Genotypen moduliert. Im Vergleich zu gut gemischten Umgebungen gleicht die räumliche Segregation unter strukturierten Bedingungen die konkurrierenden und kooperativen Interaktionen aus, um die Gemeinschaft zu stabilisieren12. Beispielsweise ermöglicht die physikalische Trennung in porösen Medien die Koexistenz langsam wachsender Arten mit schnell wachsenden Konkurrenten, da die schnelle Biofilmbildung den Flüssigkeitsfluss blockiert und Nährstoffe zu ihren Konkurrenten umleitet13,14. Ein kürzlich durchgeführtes Experiment zeigte auch, dass die räumliche Trennung von Biofilm-Konsortien die gegenseitige Einspeisung von Metaboliten und das mikrobielle Wachstum steuert, indem sie die Genauigkeit der Quorum-Sensing-Signalübertragung abstimmt15. Das derzeitige Verständnis von durch Wechselwirkungen abgeleiteten unterirdischen Biofilmgemeinschaften beruht jedoch größtenteils auf Gemeinschaften mit zwei Arten. Wie mikrobielle Interaktionen verschiedene Biofilmgemeinschaften in räumlich strukturierten Umgebungen prägen, ist noch wenig verstanden.

Hier untersuchten wir den Prozess der Biofilmbesiedlung in einem porösen Medium, in dem sich Bodenbakterien selbst zu strukturierten mikrobiellen Gemeinschaften zusammenschließen. Mithilfe von Mikrofluidik, 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) beobachteten wir, dass Arten mit Biofilmmangel während der frühen Biofilmentwicklung die Mikroumgebung aktiv für die Kolonisierung von Oberflächen durch biofilmbildende Mikroben vorbereiteten. Darüber hinaus führten wir Exometabolomik, Transkriptomik, paarweise Interaktionsanalysen und genetische Manipulation durch, um die Mechanismen interspezifischer Interaktionen aufzudecken. Wir stellen fest, dass die Interaktion zwischen Biofilm-defizienten und Biofilm-bildenden Arten die Nachfolge mikrobieller Gemeinschaften durch aktive räumliche Segregation in der Untergrundumgebung vorantreibt.

Wir haben einen mikrofluidischen Chip entwickelt, der aus einer Reihe von Säulen besteht (analog zu Körnern unter der Oberfläche), die den porösen Medien unter der Oberfläche ähneln (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1). Der kolloidale Transport und die Retention in der Mikrofluidikkammer wurden charakterisiert, um den Aufenthalt planktonischer Zellen zu bewerten. Basierend auf der Durchbruchskurve fluoreszierender Mikrokügelchen (ergänzende Abbildung 2) betrug die mittlere Reisezeit der Kolloidpartikel 51,48 ± 2,16 Minuten. Dies deutet darauf hin, dass sowohl Biofilm- als auch Planktonzellen ausreichend Verweilzeit haben, um im porösen Medium zu wachsen. Das Mikrofluidikgerät wurde mit einer aus dem Boden extrahierten komplexen Mikrobengemeinschaft beimpft und dann mit dem aus derselben Bodenprobe hergestellten Bodenextraktmedium versorgt. Die Entwicklung eines Biofilms wurde durch die Bildung kleiner Mikrobenkolonien auf dem Korn eingeleitet (Abb. 1b). Nach 72-stündigem Wachstum begannen Biofilme, die Kornoberfläche zu bedecken, sich in den Porenraum auszudehnen und schließlich die Kanäle der porösen Matrix zu verstopfen. Basierend auf der quantitativen Bildanalyse nahm die Rauheit des Biofilms nach 72 Stunden signifikant zu (Abb. 1c). Die erhöhte Rauheit, die typischerweise auf die Bildung reifer Biofilme hinweist, vergrößert die Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Biofilm, um einen effizienten Stofftransport von Nährstoffen zu Biofilmen zu ermöglichen16,17. Die Menge an Plankton- und Biofilmzellen wurde mittels qPCR quantifiziert. Sowohl die Wachstumsprofile der Plankton- als auch der Biofilmzellen in der Mikrofluidikkammer folgten einem logistischen Wachstumsmuster, das am Ende der Inkubation ein Plateau erreichte (Abb. 1d). Mit Ausnahme der ersten 24 Stunden war die Menge an Biofilmzellen deutlich höher als die der Planktongemeinschaft.

ein Schema des mikrofluidischen Geräts, das die poröse Umgebung unter der Oberfläche nachahmt. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft wird mittels 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung profiliert. Das Abwasser wird einer exometabolomischen Analyse unterzogen. b Die Entwicklung der Biofilmarchitektur in der porösen Umgebung. Biofilmzellen werden mit SYTO 9 (grün) gefärbt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Das Experiment wurde in vier unabhängigen Mikrofluidik-Chips mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c Die Dynamik der Biofilmdicke und -rauheit (n = 4 Chips × 15 Körner). Die Rauheit des Biofilms wurde als Standardabweichung der Biofilmdicke auf einzelnen Kornoberflächen berechnet. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. d Die Menge an Plankton- und Biofilmzellen in der Mikrofluidikkammer, bestimmt durch qPCR (n = 4 Chips). Die durchgezogene Linie zeigt einen abnehmenden Anteil planktonischer Zellen bei zunehmender Biofilmentwicklung. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.

Um die Nachfolge der Gemeinschaft während der Biofilmentwicklung zu untersuchen, wurde die gesamte Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaft in den Mikrofluidikchips durch 16S-Amplikonsequenzierung überwacht. Die Bray-Curtis-Unähnlichkeit der gesamten mikrobiellen Gemeinschaften zwischen benachbarten Zeitintervallen nahm mit fortschreitendem Biofilmwachstum ab (Abb. 2a). In der Anfangsphase zeigten die Vielfalt und der Reichtum der Gemeinschaft einen deutlichen Rückgang (ergänzende Abbildung 3). Nominelle Veränderungen wurden nach der Entwicklung reifer Biofilme (>72 Stunden) beobachtet und die Gemeinschaften näherten sich einem stabilen Zustand. ASV1 Pseudomonas und ASV2 Arthrobacter waren während der gesamten Inkubationszeit die beiden am häufigsten vorkommenden Amplikonsequenzvarianten (ASVs) und machten 76,4 % der Gesamtablesungen aus (Abb. 2b). Die relative Häufigkeit dieser beiden ASVs nahm im Frühstadium (<48 Stunden) gleichzeitig zu, variierte jedoch nach der Bildung reifer Biofilme (Abb. 2b).

a Die Bray-Curtis-Unähnlichkeit der Gemeinschaften zwischen benachbarten Zeitintervallen korreliert negativ mit den Inkubationsperioden (zweiseitiger Pearson r = −0,754, p = 4,69 × 10−11). Die durchgezogene Linie stellt die lineare Regression dar, während die graue Schattierung das 95 %-Konfidenzintervall angibt. b Die relative Häufigkeit der TOP 20 ASVs (die 86,3 % aller Lesevorgänge abdecken) in der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft. Linienfarben entsprechen verschiedenen ASVs in der Taxonomielegende rechts. Die durchgezogene Linie stellt den Durchschnittswert dar und die schattierten Bereiche geben die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Die relative Bedeutung verschiedener ökologischer Prozesse beim Aufbau von Biofilmgemeinschaften (n = 9 Vergleiche zwischen drei biologischen Replikaten zu jedem Zeitpunkt und drei biologischen Replikaten für das Inokulum), einschließlich homogener Selektion (HoS), heterogener Selektion (HeS) und homogener Ausbreitung (HD). ), Ausbreitung (DL) und Drift (DR). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Bedeutung deterministischer und stochastischer Prozesse dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05, einfaktorielle ANOVA). Genaue p-Werte finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. d Der relative Beitrag verschiedener Gattungen zur Gemeinschaftssukzession. Die Spalten werden basierend auf der Taxonomie eingefärbt (siehe Taxonomielegende rechts). e FISH-Bilder des Biofilms in der Mikrofluidikkammer. Der Biofilm wird gleichzeitig mit den Sonden für Arthrobacter (ART179-Alexa546, rot) und Pseudomonas (PSE227-Alexa488, grün) hybridisiert. Biofilmzellen werden mit DAPI (blau) gefärbt. Der Anteil von Pseudomonas und Arthrobacter im Biofilm wird anhand der Fläche grün und rot fluoreszierender Zellen berechnet (n = 4 Chips × 15 Körner). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar.

Die relative Bedeutung verschiedener taxonomischer Gruppen für die gesamte Nachfolge in der Gemeinschaft wurde mithilfe einer phylogenetischen Bin-basierten Nullmodellanalyse (iCAMP)18 abgeleitet. Dieser Rahmen unterteilt beobachtete ASVs basierend auf den phylogenetischen Beziehungen in verschiedene taxonomische Gruppen. Die relative Bedeutung ökologischer Prozesse, die den Umsatz jeder Gruppe bestimmen, wird durch die Nullmodellanalyse basierend auf dem Beta Net Relatedness Index (βNRI) und der modifizierten Raup-Crick-Metrik (RC) bestimmt. Der paarweise Vergleich mit βNRI < −1,96 weist auf eine homogene Selektion hin, wohingegen der mit βNRI > 1,96 als heterogene Selektion interpretiert wird. Für die paarweisen Vergleiche mit |βNRI| wird die taxonomische Unähnlichkeitsmetrik RC angewendet ≤ 1,96. RC-Werte >0,95 oder <–0,95 stellen eine homogenisierende Ausbreitung oder Ausbreitungsbegrenzung dar, während |RC| ≤ 0,95 wird als Drift interpretiert. Die relative Bedeutung einzelner Prozesse wird mit der relativen Häufigkeit jeder taxonomischen Gruppe gewichtet und summiert, um ihre relative Bedeutung für die Steuerung der Nachfolge in der Gemeinschaft abzuschätzen. Das Ergebnis zeigt, dass die Nachfolge der mikrobiellen Gemeinschaft durch homogene Selektion vorangetrieben wurde, deren relative Bedeutung mit der Biofilmentwicklung von 39,5 % auf über 90,0 % anstieg (Abb. 2c). Auf Gattungsebene leistete Pseudomonas den größten Beitrag zur Gemeinschaftsnachfolge, gefolgt von Arthrobacter, der im Frühstadium (≤ 48 Stunden) mehr als 15 % beitrug (Abb. 2d). Diese Ergebnisse zeigen, dass die mikrobiellen Gemeinschaften nach einer vorübergehenden stochastischen Periode (≤ 12 Stunden) durch homogene abiotische und biotische Umweltbedingungen angetrieben wurden und Pseudomonas und Arthrobacter die wichtigsten Taxa waren, die die Gemeinschaftsstruktur prägten.

Um das Schicksal von Pseudomonas und Arthrobacter während der Biofilmentwicklung visuell und räumlich zu verfolgen, wurde FISH in situ in den Mikrofluidikchips mit gattungsspezifischen Sonden durchgeführt. Nach der ersten 12-stündigen Anheftung wurde eine minimale Menge oberflächenassoziierter Bakterien als Pseudomonas und Arthrobacter identifiziert und die meisten von ihnen verblieben immer noch in der Planktongemeinschaft (Abb. 2e und ergänzende Abb. 4). Bemerkenswerterweise stieg der Anteil von Pseudomonas im Biofilm nach 36 Stunden auf 70,7 ± 14,2 %, wobei die relative Häufigkeit in der Planktongemeinschaft gleichzeitig von 68,4 ± 5,2 % auf 18,5 ± 8,6 % abnahm (Abb. 2e und ergänzende Abb. 4). . Basierend auf qPCR- und Amplikonsequenzierungsanalysen (Abb. 1d, 2b und ergänzende Abb. 4) bewohnten 19, 5 ± 12, 7% der Pseudomonas in der Mikrofluidikkammer nach 12 Stunden Biofilme. Nach 36 Stunden stieg das Verhältnis weiter auf 97,3 ± 10,0 %. Der erhöhte Anteil sessiler Pseudomonas-Zellen lässt darauf schließen, dass Pseudomonas im frühen Stadium der Biofilmentwicklung einen Übergang von der Plankton- zur Biofilmbildung vollzog. Umgekehrt wurde Arthrobacter nach 36-stündigem Wachstum immer noch selten im Biofilm beobachtet, während sein Anteil in der Planktongemeinschaft von 15,8 ± 2,3 % auf 64,5 ± 10,4 % anstieg und zum am häufigsten vorkommenden Taxon in den Planktongemeinschaften wurde (Abb. 2e und ergänzende Abb . 4). Das Auftreten von Flecken, die von einer Gattung dominiert werden, stellt das Auftreten einer räumlichen Segregation im frühen Stadium der Biofilmentwicklung dar, durch die frei lebende Arthrobacter und biofilmbildende Pseudomonas die Umgebungsflüssigkeit bzw. die Kornoberfläche besetzten. Die Dominanz im Biofilm erhöht die Häufigkeit von Interaktionen zwischen Zellen mit ähnlichen Genotypen19,20,21,22, während die vorherrschenden Planktontaxa einen starken Einfluss auf den Exometabolitenpool haben können23,24. Das Auftreten räumlicher Segregation steht im Einklang mit der erhöhten Bedeutung der Selektion bei der Gemeindeversammlung (Abb. 2c, e), was darauf hinweist, dass die selektive Kraft durch räumliche Organisation entsteht.

Im Spätstadium wurde beobachtet, dass dicht gepackte Pseudomonas-Biofilme das Korn überzogen und Porenräume bedeckten, und der Anteil von Pseudomonas im Biofilm stieg nach 96 Stunden auf 84,5 ± 12,3 % (Abb. 2e). Die Planktongemeinschaft wurde von Bakterien dominiert, die aus der Biofilmgemeinschaft stammten und hauptsächlich aus Pseudomonas, Rhodococcus und Lysinibacillus bestanden (ergänzende Abbildung 4). Angesichts der gleichzeitigen Zunahme der relativen Häufigkeit (Abb. 2b) nehmen wir an, dass eine potenziell positive Wechselwirkung zwischen Pseudomonas und Arthrobacter eine räumliche Segregation induziert.

Um die zugrunde liegenden Mechanismen der räumlichen Segregation zu entschlüsseln, haben wir die individuelle Wachstumsleistung und paarweise Interaktion von Bakterienstämmen charakterisiert, die aus den Mikrofluidikchips isoliert wurden (Abb. 3a). Es wurden die zwanzig am häufigsten vorkommenden Isolate aus vier verschiedenen Gattungen ausgewählt, die zusammen 78,9 % der Gesamthäufigkeit ausmachten. Ihr Planktonwachstum und ihre Biofilmbildung in Mikroplatten wurden durch Messungen der optischen Dichte bzw. Kristallviolettfärbung untersucht. Obwohl alle Isolate im intensiven Bodenextraktmedium (ISEM) ein erhebliches Planktonwachstum zeigten, zeigten Arthrobacter-Stämme eine minimale Fähigkeit zur Biofilmbildung (Abb. 3a). Dies deutet darauf hin, dass das Aussterben von Arthrobacter im Spätstadium des Biofilmwachstums auf dessen mangelnde Biofilmbildung und das Versagen der dauerhaften Kolonisierung bei kontinuierlicher Spülung mit ISEM zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurden paarweise Interaktionsexperimente durchgeführt, um die Hypothese zu testen, dass eine positive Interaktion zwischen frei lebenden Arthrobacter- und Biofilmbewohnern eine räumliche Segregation induziert (Abb. 3a). Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten intergenerischen Interaktionen zwischen Arthrobacter-Stämmen und den biofilmbildenden Isolaten Pseudomonas und Rhodococcus positiv waren (Abb. 3a). 20 von 25 Co-Kulturkombinationen zwischen Arthrobacter und Pseudomonas wurden als positive Interaktionen (Yco > Ysum) zugeordnet.

a Das individuelle Wachstum und die paarweise Co-Kultur-Interaktion zwischen Arthrobacter-Stämmen und Isolaten aus anderen drei Gattungen in ISEM. Das individuelle Planktonwachstum wird mit OD600 gemessen. Die Biofilmausbeute wird durch OD590 nach Kristallviolettfärbung quantifiziert. Basierend auf der minimalen (Ymin), dem durchschnittlichen (Yave), dem maximalen (Ymax) und der summierten (Ysum) Monokultur-Biofilmausbeute jedes Mitglieds in der Co-Kultur und der Co-Kultur-Biofilmausbeute (Yco) kann die paarweise Interaktion als klassifiziert werden positiv (Yco > Ysum), stark negativ (Yco < Ymin) oder schwach negativ (Ysum ≥ Yco ≥ Ymin). b Wichtige differenziell exprimierte Gene im Zusammenhang mit der Biofilmbildung von ASV1 P. fluorescens in Co-Kultur mit ASV2 A. ramosus. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der unterschiedlich exprimierten Gene mit den gleichen Funktionen an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die Interaktion in ISEM wird durch planktonische Arthrobacter (c) und biofilmbildende Isolate (d) bedingt. Basierend auf dem Biofilm- oder Planktonwachstum in konditioniertem Medium (Yc) und unkonditioniertem Medium (Yu) kann die Wechselwirkung als positiv (Yc ≥ Yu), schwach negativ (1 > Yc/Yu ≥ 0,5) oder stark negativ (Yc/ Yu < 0,5). Die Quelldaten für Abb. 3a, c werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Der gemessene OD600 für Abb. 3d wurde in der ergänzenden Abb. 10a dargestellt.

Da der Kristallviolett-Assay die gesamte Biofilm-Biomasse in der Co-Kultur quantifizierte, wurde die Häufigkeit von Arthrobacter und biofilmbildenden Isolaten im Plankton, Biofilm und in der Gesamtgemeinschaft mithilfe von qPCR quantifiziert, um ihre individuelle Fitness zu bewerten. Die Gesamtzellzahl von Arthrobacter und biofilmbildenden Stämmen in 41 und 36 von 50 Co-Kulturmischungen war jeweils signifikant höher als in Monokultur (Ergänzende Abbildungen 5 und 6). In Übereinstimmung mit der beobachteten räumlichen Gemeinschaftsstruktur in Mikrofluidikkammern (Abb. 2e) bestand der Co-Kultur-Biofilm hauptsächlich aus biofilmbildenden Arten (mittlere Häufigkeit biofilmbildender Stämme im Biofilm = 0,605, Wilcoxon-signierter Rangtest gegenüber 0,5). , n = 50 Kombinationen, p = 8,88 × 10−5) und das Plankton wurde von Arthrobacter dominiert (mittlere Häufigkeit von Arthrobacter-Stämmen im Plankton = 0,878, Wilcoxon-signierter Rangtest gegenüber 0,5, n = 50 Kombinationen, p = 7,79 × 10−10). Nach 24-stündigem Wachstum waren die Arthrobacter-Häufigkeiten in allen 50 Co-Kulturkombinationen mit den anfänglichen Anteilen vergleichbar (Wilcoxon-signierter Rangtest versus Arthrobacter-Häufigkeit im Inokulum, n = 4 Replikate für jede Kombination, p > 0,05), was darauf hindeutet dass sich Arthrobacter und biofilmbildende Arten in der Co-Kultur nicht gegenseitig ausschlossen.

Integrierte genomische und transkriptomische Analysen von zwei Co-Kulturkombinationen (ASV2 A. ramosus-ASV1 P. fluorescens und ASV2 A. ramosus-ASV11 R. erythropolis) wurden durchgeführt, um die Transkriptionsreaktionen in interspezifischen Interaktionen aufzudecken. Die gemeinsame Kultur mit A. ramosus induzierte die unterschiedliche Expression von 2165- und 161-Genen in P. fluorescens bzw. R. erythropolis. Basierend auf der Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) wurden die Stoffwechselwege einschließlich oxidativer Phosphorylierung, Kohlenstoffstoffwechsel, Ribosomen- und Citratzyklus von P. fluorescens in Co-Kultur aktiviert (ergänzende Abbildung 7). Neben hochregulierten Stoffwechselwegen wurden auch Gene von P. fluorescens, die mit der Biofilmbildung in Zusammenhang stehen, stark exprimiert. Sowohl die Biosynthesegene für intra- als auch interzelluläre Biofilm-Signalmoleküle, dh c-di-GMP und Chinolonsignal (PQS), wurden in der Co-Kultur signifikant hochreguliert (Abb. 3b). Die Aktivierung der Biofilm-Signalsynthese entsprach den hochregulierten Synthese- und Exportwegen für Exopolymere, einschließlich Adhäsin LapA, extrazellulärem Polysaccharid und Lipopolysaccharid. Darüber hinaus wurden die Gene von P. fluorescens, die für die Synthese kooperativer öffentlicher Güter wie Siderophor (Staphyloferrin) und Elektronenshuttles (Riboflavin (RF), Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD)) verantwortlich sind, deutlich hochreguliert, um ein Kollektiv bereitzustellen Vorteil (Abb. 3b). Die GESA-Analyse ergab, dass die Co-Kultur auch den Aminosäurestoffwechsel und die Biosynthese von Sekundärmetaboliten in R. erythropolis hochregulierte (ergänzende Abbildung 7). Jeder dieser beiden biofilmbildenden Stämme aktivierte vier verschiedene Stoffwechselwege für Aminosäuren. Insgesamt 237 bzw. 263 Gene, die an der Biosynthese von Cofaktoren und Sekundärmetaboliten beteiligt sind, wurden in P. fluorescens bzw. R. erythropolis positiv angereichert. Die induzierte Biofilmbildung wurde in der Mikrofluidikkammer validiert. A. ramosus induzierte einen 2,3- bzw. 4,4-fachen Anstieg der Biofilmdicke von P. fluorescens bzw. R. erythropolis (ergänzende Abbildung 8). Mittlerweile wurden in der Co-Kultur mit P. fluorescens und R. erythropolis im Vergleich zur Monokultur nur 126 und 88 Gene des Stamms A. ramosus unterschiedlich exprimiert (ergänzende Abbildung 9). In diesen beiden Co-Kultursystemen teilte A. ramosus hochregulierte Eisengewinnungsgene wie efeUOB und herunterregulierte Gene für den Peptid-/Nickeltransport.

Da frei lebende Arthrobacter und biofilmbildende Bakterien in der porösen Umgebung räumlich getrennt waren (Abb. 2e und ergänzende Abb. 4), nehmen wir an, dass die kooperative Interaktion über extrazelluläre Metaboliten vermittelt wurde. Um dies zu testen, wurden biofilmbildende Isolate in einem konditionierten Medium gezüchtet, das durch Mischen von frischem ISEM und verbrauchtem Arthrobacter-Medium im Verhältnis 1:125 hergestellt wurde (Abb. 3c). Das verbrauchte Arthrobacter-Medium war der zellfreie Kulturüberstand von Arthrobacter, der 48 Stunden lang in ISEM gezüchtet wurde. In Übereinstimmung mit den Co-Kultur-Experimenten verstärkte das durch Arthrobacter-Stämme konditionierte Medium die Biofilmbildung von Pseudomonas und Rhodococcus erheblich (Abb. 3c). Andererseits steigerte ISEM, konditioniert durch ASV1 P. fluorescens und ASV11 R. erythropolis, das Wachstum der meisten Arthrobacter-Stämme signifikant (Abb. 3d und ergänzende Abb. 10a). Das verstärkte Wachstum wurde auch in M9-Minimalmedium beobachtet, das durch ASV1 P. fluorescens und ASV11 R. erythropolis konditioniert war (ergänzende Abbildung 10b), was darauf hindeutet, dass Arthrobacter-Stämme von den Metaboliten profitierten, die von den biofilmbildenden Stämmen abgesondert wurden. Da im Überstand von ASV1 P. fluorescens, der in ISEM gezüchtet wurde, öffentliche Güter wie Siderophor, FMN und FAD nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildungen 11 und 12), untersuchten wir weiter, ob Arthrobacter diese öffentlichen Güter durch die Konstruktion der Siderophor-Synthesemutante in ASV1 P nutzte . fluorescens (ΔsfnaD) und Zugabe von Flavinen zu den Kulturmedien. Die Löschung des Siderophor-Synthetase-Gens verringerte das Wachstum der meisten Arthrobacter-Stämme im verbrauchten Medium von ASV1 P. fluorescens (ergänzende Abbildung 13). Unterdessen steigerte die Ergänzung von Flavinen in der gleichen Menge wie das durch ASV1 P. fluorescens konditionierte ISEM das Wachstum von Arthrobacter sowohl im ISEM- als auch im M9-Medium erheblich (ergänzende Abbildung 14). Diese Ergebnisse stützen unsere Hypothese, dass ausgeschiedene Metaboliten von frei lebenden Arthrobacter durch die Förderung der Biofilmbildung eine räumliche Segregation induzieren können, was gleichzeitig die Fitness von Arthrobacter in Planktongemeinschaften durch die Produktion öffentlicher Güter verbessert.

Um die durch Exometaboliten bedingte räumliche Segregation zu verstehen, wurde die Dynamik extrazellulärer Metaboliten in den Ausflüssen von Mikrofluidik-Chips durch ungezielte Metabolomics-Analyse entschlüsselt. Insgesamt wurden 162 Metaboliten identifiziert, von denen Aminosäuren (AAs) und ihre Derivate (24,0 %) sowie Fettsäuren (13,0 %) die Hauptbestandteile waren. Die Procrustes-Analyse ergab eine starke und hochsignifikante Korrelation zwischen Exometaboliten und der Gesamtzusammensetzung der Gemeinschaft in den Mikrofluidikchips (Abb. 4a). Im Einklang mit den Gemeinschaftsstrukturen unterschieden sich die Exometabolitenprofile im Frühstadium von denen im Spätstadium. Alle gemessenen Exometaboliten wurden basierend auf ihrer Dynamik während der Biofilmentwicklung in drei Cluster eingeteilt, einschließlich freigesetzter (Cluster 1), verbrauchter (Cluster 2) und anderer (Cluster 3) (Ergänzende Abbildungen 15–18). Mutmaßliche Kohlenhydrate (z. B. Laktose) und Purine wurden nach der Inokulation schnell verbraucht (ergänzende Abbildung 17). Eine Reihe mutmaßlicher AAs und ihrer Derivate, gruppiert in Cluster 1, sammelten sich während der Biofilmentwicklung an (ergänzende Abbildung 16). Die Rangkorrelation nach Spearman wurde berechnet, um die Direktionalität der Mikroben-AA-Beziehungen zu bewerten (Abb. 4b). Während der gesamten Inkubationszeit korrelierten 11 von 18 identifizierten Aminosäuren negativ mit der relativen Häufigkeit von Arthrobacter und 8 von ihnen zeigten eine positive Beziehung zu Pseudomonas. Dies impliziert, dass diese beiden dominanten Gattungen unterschiedliche Rollen im Aminosäurestoffwechsel spielen.

a Procrustes-Rotation des Diagramms der nichtmetrischen mehrdimensionalen Skalierung (NMDS) der gesamten Mikrobiota-Zusammensetzung mit dem Metabolom-NMDS-Diagramm (Procrustes-Korrelation = 0,72, p = 0,001). b Korrelation zwischen den ASVs (relative Häufigkeit >0,1 % über die gesamten mikrobiellen Gemeinschaften in Mikrofluidik-Chips) und Aminosäuren. Es werden nur diejenigen mit Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman (|r| ≥ 0,5, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05) angezeigt. ACC, 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure; Ect, Ectoin; 2-Akbt, 2-Amino-3-oxobuttersäure. c Die Ansammlung der gesamten Aminosäuren im Überstand (n = 3 Chips). d Die Dynamik von DAA während der Biofilmentwicklung weist ein V-Muster auf (n = 3 Chips). Die schattierten Bereiche stellen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da die Metabolomik bei der Identifizierung von Metaboliten zu falsch positiven Ergebnissen führen kann, wurden die Konzentrationen freier Aminosäuren und ihrer Enantiomere nach der Derivatisierung durch spektroskopische Detektion bestimmt. Die anfängliche Gesamtkonzentration an freien Aminosäuren in ISEM betrug 63,7 mg/l (Abb. 4c) und bestand hauptsächlich aus Thr, Val, Met, Leu, Phe, His und Lys. In Übereinstimmung mit der ungezielten Metabolomanalyse stieg die Gesamtaminosäurekonzentration im Spätstadium erheblich an und erreichte eine Endkonzentration von über 300 mg/l. Unterdessen zeigte die Dynamik von DAAs ein „V-förmiges“ Muster, das bei der Inokulation abnahm und sich nach 48-stündigem Wachstum anhäufte (Abb. 4d). Der Verbrauch von D-Aminosäuren stimmte gut mit dem Wachstum von Arthrobacter überein, was auf eine mögliche Rolle von Arthrobacter beim D-Aminosäuren-Verbrauch schließen lässt. Da bekannt ist, dass D-Aminosäuren die Bildung von Biofilmen unterdrücken, indem sie die anfängliche Bindung, die EPS-Produktion und das Quorum Sensing hemmen26,27,28,29, schlagen wir vor, dass der Verbrauch von D-Aminosäuren das zentrale Stoffwechselmerkmal ist, das die räumliche Segregation auslöst.

Die isolierten Stämme wurden in ISEM kultiviert, um die Fähigkeit zur DAA-Entfernung zu testen. Die anfängliche DAA-Konzentration von ISEM betrug 44,1 mg/L. Arthrobacter-Stämme entfernten etwa 90 % der DAA innerhalb von 48 Stunden und zeigten die höchste DAA-Verbrauchskapazität (Abb. 5a). Unterdessen verblieb eine DAA-Konzentration von etwa 60 % in der Pseudomonas-Kultur. Im Vergleich zu ISEM sank die DAA-Konzentration im durch Arthrobacter konditionierten ISEM auf ~25 mg/L (frisches ISEM gemischt mit dem Überstand der Arthrobacter-Kultur im Verhältnis 1:1). Bei verringerter DAA-Konzentration war die Biofilmbildung von Pseudomonas und Rhodococcus im konditionierten Medium im Vergleich zu der in ISEM verstärkt (Abb. 3c). Um die Rolle von DAAs bei der Biofilmbildung zu validieren, wurden dem konditionierten Medium verschiedene Mengen an DAAs zugesetzt. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung mit der Erhöhung der DAA-Konzentration gehemmt wird. Es wurde festgestellt, dass eine Konzentration von 45 mg/L DAAs in konditionierten Medien, die dem ISEM-Spiegel entsprach, eine Verringerung der Pseudomonas- und Rhodococcus-Biofilmbildung um 31,8 ± 7,9 % bzw. 27,7 ± 6,4 % verursachte (Abb. 5b). Insgesamt stützen diese Ergebnisse nachdrücklich unsere Hypothese, dass Arthrobacter durch die Entfernung des Biofilminhibitors DAAs eine räumliche Segregation induziert.

a Die verbleibenden DAAs in ISEM nach 48-stündigem Wachstum jedes Isolats (n = 3 biologisch unabhängige Replikate). Das Balkendiagramm zeigt die gesamten verbleibenden DAAs in der Kultur. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. b Die relative Biofilmbildung im konditionierten Medium mit unterschiedlichen DAA-Werten (n = 5 Isolate für jede Gattung × 3 Replikate). Die Biofilm-Biomasse jedes Isolats, angegeben durch OD590, wird auf die im konditionierten Medium mit 25 mg/L D-Aminosäure entwickelte Biomasse normalisiert. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05, einfaktorielle ANOVA). Genaue p-Werte finden Sie in der Ergänzungstabelle 5. Die Boxplots zeigen den 1,5-fachen Interquartilbereich (Whisker), die Quartile und den Median der relativen Biofilmbiomasse.

Poröse Umgebungen unter der Oberfläche wie Boden und Sedimente sind einer der wichtigsten mikrobiellen Lebensräume auf der Erde1,2. In diesen Umgebungen ist die Bildung von Biofilmen eine grundlegende Lebensstrategie für Mikroorganismen. Die komplexen Interaktionen innerhalb lokaler Gemeinschaften führen zu Vielfalt und Stabilität in der Gemeinschaft. Die Rolle mikrobieller Interaktionen bei der Gestaltung komplexer natürlicher Biofilm-Gemeinschaftsfolgen wird jedoch selten untersucht. Hier zeigen wir mithilfe einer mikrofluidischen Chipumgebung, dass eine positive mikrobielle Interaktion die räumliche Struktur der Gemeinschaft während der Biofilmbesiedlung beeinflusst. Biofilm-defiziente oder planktonischere Arthrobacter lösen die Biofilmbildung durch die Entfernung von Biofilm-Inhibitoren aus. Mit dem verringerten Gehalt an Biofilm-Inhibitoren reduzierte Pseudomonas, die am häufigsten vorkommende Gattung in der Gesamtgemeinschaft, seinen Anteil in der Umgebungsflüssigkeit und wechselte zu einem sessiven Lebensstil. Die räumliche Trennung wurde auch in Co-Kulturen beobachtet, die Arthrobacter- und Pseudomonas-Stämme mit vergleichbaren anfänglichen Zelldichten enthielten. Die paarweisen Interaktionsanalysen ergaben, dass Arthrobacter und biofilmbildende Stämme das Plankton bzw. den Biofilm in den Co-Kultursystemen dominierten. Der Anteil der Pseudomonas, die Biofilme in der Co-Kultur besiedelten, war signifikant höher als der in der Monokultur (p <0,001, einfache ANOVA, Ergänzungstabelle 6). Obwohl das Wachstum in ISEM- und M9-Minimalmedium mit unterschiedlichen DAA-Gehalten darauf hindeutet, dass Arthrobacter durch die DAA-Hydrolyse keine Fitnessvorteile erhält (ergänzende Abbildung 19), erhält es Gegenvorteile durch biofilmbildende Arten, die öffentliche Güter absondern. Die für beide Seiten vorteilhafte Interaktion erleichtert die Besetzung getrennter Nischen durch frei lebende Arthrobacter und biofilmbildende Bakterien und prägt die räumliche Organisation der Gemeinschaft. Dies weist darauf hin, dass die planktonischen mikrobiellen Minderheiten einen starken Selektionsdruck auf die Nachfolge von Biofilmgemeinschaften ausüben können, indem sie als Inhibitorfänger fungieren und dadurch ihre eigene Fitness in der Porenflüssigkeit verbessern.

Simulierte und experimentelle Ergebnisse haben gezeigt, dass räumliche Segregation im Allgemeinen ein Ergebnis konkurrierender Interaktionen in strukturierten Umgebungen ist5,30,31. Da sich konkurrierende Mikroorganismen gegenseitig ausschließen, trägt die räumliche Segregation zum stabilen Zusammenleben der Konkurrenten bei und erhöht die Vielfalt der Gemeinschaft12,32. Insbesondere biofilmbildende Arten erlangen in natürlichen Umgebungen Wettbewerbsvorteile gegenüber frei lebenden oder Biofilm-defizienten Arten. Frühere Studien ergaben, dass biofilmbildende Arten frei lebende Zellen verdrängen, indem sie sie ersticken oder den Nährstoffzugang abschneiden33,34. Im Gegensatz dazu zeigen wir, dass frei lebende Arten, die bisher als die unterlegenen Arten galten, tatsächlich eine wechselseitige Zusammenarbeit mit biofilmbildenden Zellen aufbauen können. Im frühen Stadium der Kolonisierung fangen die frei lebenden Mikroben den universellen Biofilminhibitor ab, um die Biofilmbildung einzuleiten. Mit reduzierter Hemmwirkung verlassen biofilmbildende Zellen die Umgebungsflüssigkeit, um Kornoberflächen zu besiedeln und im Gegenzug öffentliche Güter abzusondern. Diese frühen Oberflächensiedler können die Mikrohabitate schnell verhindern oder verändern, was sich auf die Kolonisierung spät ankommender Arten auswirkt und die nachfolgende Nachfolge von Gemeinschaften vorantreibt8,35,36. Dies deutet darauf hin, dass die kooperative Interaktion zwischen frei lebenden und biofilmbildenden Partnern eine zentrale Rolle bei der Besiedlung unberührter Gebiete spielen könnte.

Wir stellen fest, dass DAAs die Schlüsselmetaboliten sind, die die räumliche Trennung in unserem System vermitteln. Die Veränderungen der DAAs während der Biofilmbesiedlung zeigen ein V-förmiges Muster. Im Spätstadium nahm die Häufigkeit von Arthrobacter, die DAAs effizient hydrolysieren konnten, aufgrund der mangelnden Biofilmbildung deutlich ab. Die mittlere Reisezeit von Kolloiden in der Mikrofluidikkammer verringerte sich von 51,48 ± 2,16 auf 30,72 ± 5,16 Minuten nach der Biofilmentwicklung (zweiseitiger Student-t-Test, n = 3 unabhängige Wiederholungen für jede Bedingung, p = 0,011, ergänzende Abbildung 2). ), was auf eine beschleunigte Elution planktonischer Arthrobacter im Spätstadium hinweist. Das Aussterben von Arthrobacter in den porösen Umgebungen führte zu einer verminderten Stoffwechselfähigkeit der verbleibenden mikrobiellen Gemeinschaft gegenüber DAAs, deren Konzentration im Abwasser allmählich auf das ursprüngliche Niveau in ISEM anstieg (Abb. 4d). Als häufige Gruppe von Sekundärmetaboliten und Hauptbestandteilen von Bakterienwänden können diese Aminosäure-Enantiomere aktiv ausgeschieden und passiv an die Umgebung abgegeben werden37,38. Mikromol DAA pro Gramm Trockengewicht wurden im Sediment und im Boden nachgewiesen37,39,40. Da DAAs in diesem Konzentrationsbereich ausreichen, um die Biofilmbildung zu unterdrücken26,27, können sie daher eine allgegenwärtige Rolle bei der Steuerung der Struktur der Biofilmgemeinschaft in einem breiten Spektrum von Ökosystemen spielen.

Diese Studie liefert ein mechanistisches Verständnis dafür, wie mikrobielle Interaktionen die Nachfolge von Biofilmgemeinschaften in porösen Umgebungen unter der Oberfläche steuern können. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um die Rolle verschiedener biotischer Interaktionen wie Konkurrenz und Gegenseitigkeit bei der Gestaltung der ökologischen Stabilität und Funktionen komplexer Biofilmgemeinschaften zu untersuchen und diese Ergebnisse in realen Böden und mikrobiellen Gemeinschaften zu validieren. Diese experimentelle Plattform kann angepasst werden, um eine In-situ-Visualisierung zu ermöglichen und mehrere Omics-Technologien zu integrieren, um die räumlich-zeitliche Dynamik mikrobieller Aktivitäten und zugrunde liegender Mechanismen aufzuklären, was unser Verständnis der räumlichen Organisation mikrobieller Gemeinschaften und funktioneller Merkmale in Ökosystemen verbessern wird.

Im November 2017 wurden Bodenproben aus einem Reisfeld der National Agro-Ecosystem Observation and Research Station (Provinz Jiangxi, China, 116°55'E, 28°15'N) bis zu einer Tiefe von 0–20 cm entnommen. Bodenproben wurden gemahlen, um durch ein 10-Mesh-Sieb zu passieren, und die Mikroorganismen wurden mithilfe der Nycodenz-Gradientenzentrifugation extrahiert41.

Ein auf Bodenextrakt basierendes Intensiv-Bodenextraktmedium (ISEM) wurde nach früheren Arbeiten unter Verwendung derselben Bodenprobe für die Extraktion von Bodenmikroorganismen hergestellt42. Kurz gesagt, 500 g trockener Boden wurden mit 1,3 l 80 % Methanol gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Überstand wurde gesammelt und der restliche Boden wurde ein zweites Mal extrahiert. Die beiden Überstände wurden vereinigt, durch ein Zellulosefilterpapier geleitet und einer Gefriertrocknung unterzogen. Die lyophilisierte Probe wurde in 200 ml Wasser gelöst und durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde als Bodenextraktlösung bezeichnet. Jeder Liter ISEM bestand aus 0,2 l Bodenextraktlösung, 0,23 g KH2PO4, 0,23 g K2HPO4, 0,23 g MgSO4·7H2O, 0,33 g NH4NO3, 0,25 g NaHCO3, 5 mg jeder D-Aminosäure (D-Valin, D-Methionin). , D-Leucin, D-Phenylalanin, D-Threonin und D-Tryptophan), 1 ml der Vitamin-Stammlösung (Thiaminhydrochlorid, 0,5 g/L; Riboflavin, 0,5 g/L; Niacin, 0,5 g/L; Pyridoxin HCl, 0,5 g/L; Inositol, 0,5 g/L; Calciumpantothenat, 0,5 g/L; β-Aminobenzoesäure, 0,5 g/L; Biotin, 0,25 g/L), 2 ml der Selenit-Wolframat-Lösung (NaOH). , 0,5 g/L; Na2SeO3·5H2O, 3 mg/L; Na2WO4·2H2O, 4 mg/L) und 2 ml der Spurenelementlösung SL-10 (HCl, 2,8 g/L; FeCl2·4H2O, 1,5 g/L) L; ZnCl2, 70 mg/L; MnCl2·4H2O, 100 mg/L; H3BO3, 6 mg/L; CoCl2·6H2O, 190 mg/L; CuCl2·2H2O, 2 mg/L; NiCl2·6H2O, 24 mg/L L; Na2MoO4·2H2O, 36 mg/L)43,44. Der pH-Wert von ISEM wurde durch Zugabe von HCl oder NaOH auf 6,8 eingestellt. Drei ISEM-Chargen wurden hergestellt, um die Variationen von Charge zu Charge zu bewerten. Auf der Grundlage der dreidimensionalen Anregungs-Emissions-Matrix (3D-EEM) und der UV-Vis-spektroskopischen Analysen war die Zusammensetzung von ISEM über die unabhängigen Chargen hinweg konsistent (ergänzende Abbildung 20). M9-Minimalmedium wurde hergestellt, um den Einfluss von DAA auf das mikrobielle Wachstum zu bewerten. Das Minimalmedium bestand aus 2,0 g/L Glucose, 6,0 g/L Na2HPO4, 3,0 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl, 0,12 g/L MgSO4, 11,1 mg/L CaCl2, 3,49 µg/L L (NH4)6Mo7O24, 24,73 µg/L H3BO3, 3,90 µg/L CoCl2, 1,60 µg/L CuSO4, 10,07 µg/L MnCl2, 1,61 µg/L ZnSO4 und 0,15 mg/L FeSO4.

Die Mikrofluidikkammer enthält eine Matrix aus Säulen mit einem Durchmesser und einer Höhe von jeweils 50 μm. Das Mikrokanaldesign wurde über ein Laserschreibsystem (Microwriter ML3) auf einen Siliziumwafer belichtet. Zur Erzeugung der mikrofluidischen Struktur wurde tiefes reaktives Ionenätzen in der AZ400K:H20 (1:4)-Lösung durchgeführt. Der geätzte Siliziumwafer diente als Urform zum Gießen von Kanälen aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Das gemusterte PDMS wurde nach der Plasmabehandlung auf einen Objektträger aus Glas geklebt. Die Mikrofluidik-Chips wurden vor der Beimpfung mit 75 % Ethanol sterilisiert.

Der Mikrofluidikchip umfasste einen Strömungskanal mit einem Einlass und einem Auslass. Der Einlassschlauch verband den Mikrofluidikchip mit einer Spritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert war, um frisches ISEM für das mikrobielle Wachstum zuzuführen. Das Abwasser, das frei lebende (planktonische) Zellen und Exometaboliten enthielt, wurde am Auslass gesammelt. Das kontinuierliche Flusssystem bot eine genau definierte und konstante Bedingung für die Biofilmentwicklung und ermöglichte die kontinuierliche Überwachung der Planktongemeinschaft und der Exometabolitendynamik. Aus dem Boden isolierte mikrobielle Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine endgültige OD600 von 0,1 resuspendiert. 200 μl Bodenbakteriensuspension wurden über eine Impföffnung unmittelbar stromabwärts des Mediumeinlasses in Mikrofluidikchips eingebracht (ergänzende Abbildung 21a). Der Einlassschlauch wurde vor der Beimpfung abgeklemmt, um einen Rückfluss zu verhindern. Die Edelstahlnadel wurde nach der Injektion des Inokulums entfernt, gefolgt von einer sofortigen Abdichtung der Impföffnung mit Silikonkleber (ergänzende Abbildung 21b). Nach einer einstündigen Anbringung wurde ISEM mit einer konstanten Flussrate von 0,5 μL/min versorgt. Die mikrofluidischen Chips wurden bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Edelstahlnadel und der Schlauch am Auslass wurden vor der Probenahme durch sterile ersetzt. Der Ausfluss von Mikrofluidik-Chips wurde gesammelt, um die Zelldichte planktonischer Gemeinschaften zu bestimmen. Anschließend wurden zwei sterile Spritzen an den Einlass und Auslass des Mikrofluidikgeräts angeschlossen. 1 ml PBS-Puffer wurde zwischen diesen beiden Spritzen wiederholt mit einer Flussrate von etwa 1.200 μL/min zwanzig Mal hin und her gespült, um alle Bakterienzellen in der Mikrofluidikkammer zu extrahieren. Die Menge an Planktonzellen und die gesamten mikrobiellen Zellen in den Mikrofluidikchips wurden durch qPCR unter Verwendung des Primerpaars Eub338F (ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG) und Eub518R (ATT ACC GCG GCT GCT GG) quantifiziert. Um die Standardkurve für qPCR zu erstellen, wurde das PCR-Produkt aus dem Modellorganismus P. putida KT2440 in den pMD8-T-Vektor kloniert und in kompetente E. coli DH5α-Zellen elektroporiert. Anschließend wurden serielle Verdünnungen der Plasmid-DNA mit dem SYBR Green PCR Supermix (BioRad) amplifiziert. Die anhand der Standardkurve ermittelte Verstärkungseffizienz betrug 104,7 %. Die Spezifität des amplifizierten Produkts wurde durch Schmelzkurvenanalyse und Gelelektrophorese bestätigt (Ergänzende Abbildungen 22 und 23). Die Menge an Biofilmzellen wurde als Differenz zwischen der Gesamtzahl und der Planktonzellzahl berechnet:

Dabei sind Cplanktonisch und Cbiofilm die Plankton- und Biofilmzellzahlen in der Mikrofluidikkammer, Dplanktonisch die Zelldichte im Abfluss der Mikrofluidikkammer, Vchip das Volumen der Mikrofluidikkammer (3,0 μl) und Centire die Gesamtzellzahl in das PBS-Eluat.

Um die Verweilzeit planktonischer Zellen in der Mikrofluidikkammer zu bewerten, haben wir den Transport und die Retention kolloidaler Mikrokügelchen im porösen Medium charakterisiert. Die von Jiangsu Zhichuan Technology Co. (China) gekauften rot fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen haben einen Durchmesser von 2 μm und eine Dichte von 1,05 g/cm3. 3 μl PBS-Puffer mit den fluoreszierenden Mikrokügelchen (1,0 × 105 Partikel/μl) wurden mit einer Flussrate von 0,5 μl/min in die Mikrofluidikkammer gepumpt. 1,5 μl Abwasser wurden alle 3 Minuten mit einer Pipette am Auslass gesammelt und dann in 50 μl PBS-Puffer in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen verdünnt. Die Partikeldichte im Abwasser wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität (Anregung 370 nm; Emission 610 nm) bestimmt (ergänzende Abbildung 2c). Es wurden drei unabhängige Wiederholungen durchgeführt. Die mittlere Reisezeit (τ) wurde wie folgt berechnet45,46:

Dabei ist T die Dauer der Experimente und C(t) die Partikeldichte im Abwasser zum Zeitpunkt t.

Biofilme in Mikrofluidikkammern wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und unter einem konfokalen Mikroskop (A1R, Nikon) beobachtet. Mikrobielle Zellen wurden 30 Minuten lang mit DAPI oder SYTO 9 gefärbt. Beide Fluoreszenzfarbstoffe binden an genomische DNA und erzeugen überlappende Fluoreszenz (ergänzende Abbildung 24). Konfokale Bilder wurden mit einem speziell geschriebenen MATLAB-Code analysiert. Nach der Bildbinarisierung wurde die Biofilmdicke auf jedem Korn als durchschnittlicher radialer Abstand von Punkten an den Biofilmrändern zur Kornoberfläche berechnet. Die Rauheit des Biofilms wurde durch die Standardabweichung der Biofilmdicke auf Kornoberflächen dargestellt46.

PSE227-Alexa488 (5′-AAT CCG ACC TAG GCT CAT C-3′) wurde verwendet, um die Verteilung von Pseudomonas im Biofilm zu visualisieren47. Um eine FISH-Sonde für Arthrobacter-Stämme zu entwerfen, wurde mit Usearch eine Konsensussequenz für 292 Arthrobacter-Isolate aus der Mikrofluidikkammer generiert und die Sondensequenz über Primer 348,49 entworfen. Alexa546-markiertes ART179 (5′-CAT GCG TGG AGC GGT CGT-3′) wurde zur Verfolgung von Arthrobacter verwendet. Die Sonden wurden mit Reinkulturen validiert (Ergänzende Abbildungen 25 und 26). Als Positiv- bzw. Negativkontrolle wurden die universelle Bakteriensonde EUB338 (5′-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′) und die Non-Sense-Sonde (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC-3′) verwendet. Alle FISH-Sonden wurden von Thermo Fisher Scientific (Guangzhou, China) synthetisiert. Die Spezifität und Empfindlichkeit von FISH wurden durch Berechnung der Erkennungsrate bewertet, bei der es sich um den Anteil der von FISH erkannten DAPI-gefärbten Zellen handelt. Die hohen Nachweisraten positiver Proben und wenige unspezifische falsch positive Signale weisen darauf hin, dass die FISH-Analyse ein praktikabler und zuverlässiger Ansatz zur Quantifizierung von Pseudomonas und Arthrobacter ist (ergänzende Abbildung 27). FISH in Mikrofluidikkammern wurde durchgeführt50. Alle Reagenzien wurden mit einer Flussrate von 0,5 μl/min in die Mikrofluidikkammer gefördert. Der Biofilm wurde zunächst 1,5 Stunden lang in 2%iger Formaldehydlösung fixiert und 40 Minuten lang mit PBS-Puffer gewaschen. Durch die Formaldehydfixierung bleibt die Integrität des Biofilms für die anschließende Probenvorbehandlung erhalten (ergänzende Abbildung 28). Die fixierte Biofilmprobe wurde dann mit 10 mg/ml Lysozym für 40 Minuten bei 37 °C permeabilisiert, gefolgt von einem Spülschritt. Die Dehydrierung wurde durchgeführt, indem 50-, 80- und 98-prozentige Ethanollösung jeweils 20 Minuten lang durch die Kammer geleitet wurde. 2 ml des Hybridisierungspuffers enthielten 600 μl Formamid, 998 μl Wasser, 360 μl 5 M NaCl, 40 μl 1 M Tris-HCl und 2 μl 10 % SDS. Die FISH-Sonde wurde dem Hybridisierungspuffer bis zu einer Endkonzentration von 2,5 ng/μL zugesetzt. Der Hybridisierungspuffer wurde über 30 Minuten in die Kammer geladen und 3 Stunden lang bei 48 °C belassen. Anschließend wurde die Probe vor der mikroskopischen Beobachtung 40 Minuten lang mit dem Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, 102 mM NaCl, 5 mM EDTA und 0,01 % SDS) bei 48 °C gewaschen.

Um die Zusammensetzung der Mikrobengemeinschaft in Mikrofluidikkammern zu untersuchen, wurden die Mikrobenzellen in Mikrofluidikkammern mit PBS-Puffer ausgespült. Die Gesamt-DNA wurde mit dem EZNA-Boden-DNA-Kit (Omega) extrahiert. Die Universalprimer 338F/806R wurden für die 16S-rRNA-Genamplifikation51 verwendet. Die Amplifikation erfolgte mittels Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Das PCR-Programm umfasste eine 2-minütige anfängliche DNA-Denaturierung bei 98 °C; 25 Zyklen bei 98 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; und 30 s Verlängerung bei 72 °C. Die Amplikons wurden mit VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme) gereinigt und dann auf der Illumina Miseq-Sequenzierungsplattform mit 300 bp Paired-End-Reads sequenziert. An jedem Probenahmepunkt wurden die mikrobiellen Gemeinschaften, einschließlich Biofilm und Planktonzellen, von drei unabhängigen Mikrofluidik-Chips gesammelt. Planktongemeinschaften wurden durch Sammeln des Abwassers von Mikrofluidikchips bewertet.

Um die Dynamik extrazellulärer Metaboliten aufzuklären, wurde der Ausfluss der Mikrofluidikchips metabolomischen Analysen unterzogen. Von jedem der sechs unabhängigen Mikrofluidik-Chips wurden zu jedem Zeitpunkt 100 μl Abwasser gesammelt. Das Abwasser wurde durch einen 0,2-μm-Mikrozentrifugen-PVDF-Filter filtriert, um Bakterienzellen zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 400 μl vorgekühltem Methanol/Acetonitril (50/50 Vol./Vol.) verwirbelt, 30 Min. bei –20 °C belassen und dann 20 Min. bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde lyophilisiert und in 100 μl einer 50:50 Acetonitril/Wasser-Lösung resuspendiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 14.000 × g wurde der Überstand für die LC-MS/MS-Messung geerntet. Qualitätskontrollproben (QC) wurden hergestellt, indem gleiche Aliquots aller 42 während der Inkubationszeit gesammelten Abwasserproben gepoolt wurden. Fünf Aliquots von QC-Proben wurden vor der Analyse und nach jeweils zehn Läufen injiziert, um auf die analytische Varianz zuzugreifen (Ergänzende Abbildungen 29 und 30). Die ungezielte Metabolomik wurde mit dem Ultimate 3000 UHPLC-System durchgeführt, das mit einem Q-Exactive Orbitrap-Massenspektrometer ausgestattet war. Die mobile Phase A ist 0,1 % Ameisensäure und die mobile Phase B ist Acetonitril. Die Bedingungen des Lösungsmittelgradienten waren wie folgt: 0–1,0 min, 95 % A; 1,0–9,0 Min., 95 ~ 0 % A; 9,0–12,0 Min., 0 % A; 12,0–15,0 Min., 95 % A, mit einer Flussrate von 0,3 ml/Min. Die Chromatographie wurde auf einer ACQUITY UPLC BEH Amide-Säule (Waters, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm) durchgeführt. Die ESI-Quellentemperatur betrug 320 °C und die Sprühspannung wurde auf 3,5 kV eingestellt. Massenspektrenscans wurden von m/z 80 bis 1200 mit einer Akkumulationszeit von 200 ms gesammelt. Die MS/MS-Erfassung wurde im IDA-Modus (Information Dependent Acquisition) durchgeführt. Die Kollisionsenergie wurde auf 35 ± 15 eV eingestellt.

Die rohen MS-Daten wurden mit MSConvert (Version 3.0) in das mzXML-Format konvertiert und anschließend von XCMS (Version 3.2) zur Peakauswahl und -ausrichtung verarbeitet52. Die Identifizierung der Metaboliten erfolgte durch genaue Massen- und MS/MS-Abgleiche mit den Referenzbibliotheken METLIN, MassBank, LipidMaps und mzCloud53,54,55. Die MS/MS-Spektralähnlichkeit wurde mithilfe des Cosinus-Scores56 dargestellt. Die XCMS-Einstellungen waren wie folgt: Methode = „centWave“, ppm = 15, Peakwidth = c(10,60), mzwid = 0,025, minfrac = 0,5 und bw = 5. Nur Metaboliten auf Stufe 2-Identifizierung (vermutlich annotierte Verbindungen) wurden für die nachgelagerte statistische Analyse verwendet. Basierend auf der KEGG-Annotation wurden die am Aminosäurestoffwechsel beteiligten Metaboliten als Aminosäurezwischenprodukte klassifiziert.

Die rohen Sequenzierungsdaten wurden mit DADA2 (Version 2021.2.0) in QIIME2 (Version 2021.2) verarbeitet, um Paired-End-Lesevorgänge zusammenzuführen und zu entstören57,58. Die Taxonomie wurde mithilfe des Naive Bayes-Klassifikators (Version 2021.2.0) und der Greengenes-Datenbank (Version 13.8) zugewiesen59. Der phylogenetische Baum wurde mithilfe der Align-to-Tree-Mafft-Fasttree-Pipeline60,61 erstellt. Die Peakflächen der Exometabolit-Ionen wurden in Z-Scores umgewandelt. Alle Exometaboliten wurden basierend auf Spearmans Rangkorrelation zwischen den Inkubationszeiten und dem Z-Score jedes Metaboliten in drei Cluster eingeteilt (ergänzende Abbildung 15). Exometaboliten mit einem Korrelationskoeffizienten > 0,5 galten als „freigesetzt“ und solche mit einem Koeffizienten unter −0,5 als „verbraucht“62. Die übrigen Metaboliten wurden als „Sonstige“ kategorisiert.

Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft wurde mittels Nullmodellanalyse bewertet. Die Community-Assembly-Mechanismen wurden quantitativ durch eine phylogenetische Bin-basierte Nullmodellanalyse (iCAMP) unter Verwendung des Pakets „iCAMP“ (Version 1.3.4) abgeleitet18. Die Analyse wurde mit den von den Entwicklern empfohlenen Parametern18 durchgeführt. Der Schwellenwert der phylogenetischen Distanz wurde auf 0,2 festgelegt und die minimale Klassengröße betrug 12. Die 11.985 beobachteten ASVs wurden in 442 verschiedene phylogenetische Klassen klassifiziert. Die Nullmodellverteilung wurde mithilfe von 1000 Randomisierungen63 generiert. Der Nullmodellalgorithmus „Taxa Shuffle“ wurde angewendet, um die Taxa im phylogenetischen Baum zu mischen und die phylogenetische Beziehung innerhalb phylogenetischer Bins zu randomisieren64. Der β-Net-Verwandtschaftsindex (βNRI) und taxonomische β-Diversitäten unter Verwendung der modifizierten Raup-Crick-Metrik (RC) wurden ermittelt, um den ökologischen Prozess zu identifizieren, der jede Klasse bestimmt. Die Grenzwerte für den signifikanten βNRI-Wert, den signifikanten RC-Wert und das signifikante einseitige Konfidenzniveau lagen bei 1,96, 0,95 bzw. 0,975. Die relative Bedeutung verschiedener ökologischer Prozesse für den Umsatz zwischen Gemeinschaften in mikrofluidischen Chips und Inokulums sowie die Beiträge einzelner phylogenetischer Behälter zu ökologischen Prozessen wurden berechnet.

Die Bakterienkultur und das Abwasser wurden vor der Analyse durch 0,2-μm-Filter filtriert. Die gesamte freie AA-Konzentration wurde mit dem A300-Aminosäureanalysator (membraPure) bestimmt. Das System wurde mit einer zertifizierten Standard-Aminosäuremischung aus 17 proteinogenen Aminosäuren (GBW(E)100062) kalibriert. Die Standardmischung wurde zu Beginn der Analyse und nach jeweils 10 Proben injiziert, um die Stabilität der Analyseplattform zu bewerten. Die freie AA wurde mittels HPLC mit Fluoreszenzdetektion nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phtalaldehyd (OPA) und N-Isobutyryl-L-cystein (IBLC)65 quantifiziert. 0,5 μL Probe wurden mit 2,5 μL 0,4 M Boratpuffer gemischt und dann mit 0,25 μL Derivationsreagenz (260 mM IBLC und 170 mM OPA in 0,4 M Boratpuffer) umgesetzt. Nach Verdünnung mit 15 μl 0,1 %iger Essigsäure wurden 15 μl der Mischung einer HPLC-Analyse unterzogen. Die Trennung der AA-Derivate wurde auf einer Agilent Poroshell HPH-C18-Säule bei 30 °C und einer Flussrate von 0,7 ml/min durchgeführt. Eine Dualgradientenelution wurde durchgeführt, wobei die mobile Phase aus 50 mM Natriumacetat (A) und Acetonitril/Methanol/Wasser (45/45/10) (B) bestand. Der Lösungsmittelgradient war wie folgt: 0–2 min, 4 % B; 2–4 Min., 10 % B; 4–15 Min., 20 % B; 15–27 Min., 35 % B; 27–35 Min., 50 % B; 35–37, 100 % B und weitere 5 Minuten bei 100 % B gehalten. Das Eluat wurde mit einem Fluoreszenzdetektor überwacht (Anregung bei 230 nm und Emission bei 450 nm). Für jede AA und ihre Enantiomere wurden Kalibrierungskurven erstellt (ergänzende Abbildung 31). QC-Proben wurden mit 1,0, 4,0 und 9,0 mg/L vorbereitet, um die Präzision und Richtigkeit der Methode zu beurteilen, ausgedrückt als relative Standardabweichung bzw. Bias (Ergänzungstabelle 8). Drei Replikate jeder QC-Stufe wurden analysiert. Die relative Standardabweichung (RSD, %) wurde als Standardabweichung/Mittelwert × 100 berechnet. Die Abweichung (%) wurde als (gemessene Konzentration – theoretische Konzentration)/theoretische Konzentration × 100 bestimmt.

Zur Stammisolierung wurde die mikrobielle Kultur in den Mikrofluidik-Chips nach 12, 36 und 96 Stunden Wachstum gesammelt und auf einer ISEM-Agarplatte ausplattiert. Nach 5-tägiger Inkubation bei 25 °C wurden die einzelnen Kolonien gepflückt, in ISEM vorkultiviert und dann in 25 % Glycerin bei –80 °C eingefroren. Die isolierten Stämme wurden mittels Sanger-Sequenzierung mit den Universalprimern 27F/1492R identifiziert. Aus den Mikrofluidik-Chips wurden insgesamt 764 Bakterienstämme isoliert. Diese Stämme gehörten zu fünf verschiedenen Gattungen und umfassten die wichtigsten Plankton- und Biofilmmitglieder, darunter Arthrobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Staphylococcus und Pseudarthrobacter.

Die Bakterienisolate wurden in ISEM vorkultiviert. Nach 48-stündigem Wachstum wurde die Bakterienkultur mit PBS-Puffer gewaschen und auf eine OD600 von 1,0 resuspendiert. Bei der paarweisen Co-Kultur-Interaktion zwischen Arthrobacter und anderen Arten wurden 200 μl ISEM mit 1 μl jeder Kultur beimpft. Um die Wirkung von Exometaboliten von Arthrobacter-Stämmen zu bewerten, wurden Bakterienisolate in einem konditionierten Medium bestehend aus dem zellfreien Überstand der Arthrobacter-Kultur und frischem ISEM kultiviert. Der Arthrobacter-Überstand, das sogenannte Arthrobacter-verbrauchte Medium, wurde durch 48-stündiges Kultivieren von Arthrobacter-Stämmen in ISEM und anschließender Zentrifugation und Filtration hergestellt25. Das konditionierte Medium wurde durch Mischen des verbrauchten Mediums mit einem gleichen Volumen frischem ISEM hergestellt. Jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen enthielt 200 μl konditioniertes Medium, das mit 2 μl jedes Isolats beimpft wurde. Die Mikroplatten wurden 48 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Biofilme in den Mikroplatten wurden mit 1 % Kristallviolett gefärbt, mit 95 % Ethanol solubilisiert und durch Messung der Absorption bei 590 nm quantifiziert.

Die Bakterienpopulationen in Monokultur und Co-Kultur wurden durch qPCR mit gattungsspezifischen Primern quantifiziert. Die Bakterienkultur wurde wie oben für die paarweise Interaktionsanalyse beschrieben vorbereitet und kultiviert. Die anfänglichen Zellkonzentrationen des identischen Stamms in der Monokultur und in verschiedenen Co-Kulturkombinationen waren gleich. Nach 24-stündigem Wachstum wurden die an der Innenfläche der Mikroplatten anhaftenden Planktonzellen und Biofilme in der Exponentialphase gesammelt, um die relative Fitness verschiedener Stämme zu bewerten66. Die Gesamtzellzahl wurde als Summe aus Biofilm und Planktonzellen berechnet. Die DNA wurde mit dem TIANamp Bacteria DNA Kit (TIANGEN) extrahiert. Es wurden vier unabhängige biologische Replikate durchgeführt. Das PCR-Programm war wie folgt: 10 Minuten bei 95 °C, 40 Zyklen mit 15 Sekunden bei 95 °C und 60 Sekunden bei 60 °C, gefolgt von 15 Sekunden bei 95 °C und 60 Sekunden bei 60 °C. Die Primersätze waren ART-F (GGGGACATTCCACGTTT) und ART-R (GCACCTGTTTCCAGGCG) für Arthrobacter-Stämme, PSE435F (ACTTTAAGTTGGGAGGAAGGG) und PSE686R (ACACAGGAAATTCCACCACCC) für Pseudomonas-Stämme und Rho627F (ATTCCGTGGAAGGAACCCAC) und Rho885R (TCGCGTCGTTTGTGAAAA). CC) für Rhodococcus-Stämme. Die Spezifität der PCR-Produkte wurde mittels Gelelektrophorese und Schmelzkurvenanalyse überprüft (Ergänzende Abbildungen 32 und 33). Wie oben beschrieben wurden Ziel-DNA-Fragmente in den pMD8-T-Vektor kloniert, um die Standardkurven zu entwickeln (ergänzende Abbildung 33). Die aus den entsprechenden Standardkurven berechneten Amplifikationseffizienzen betrugen 94,6 % für Arthrobacter, 94,8 % für Pseudomonas und 101,5 % für Rhodococcus. Um die absolute Zellzahl abzuschätzen, wurde die Linearität zwischen der PCR-Amplifikation und der Anzahl der koloniebildenden Einheiten für jeden Stamm bestimmt (ergänzende Abbildung 34).

Bei der Co-Kultur-Interaktion wurden der minimale (Ymin), der durchschnittliche (Yave), der maximale (Ymax) und der summierte (Ysum) Biofilmertrag jedes Isolats auf der Grundlage des in Monokultur gewachsenen Biofilms bestimmt67. Die Co-Kultur-Interaktion wurde als positiv definiert, wenn die Biofilmausbeute der Co-Kultur (Yco) höher war als Ysum (Yco > Ysum). Die Beziehung wurde als negativ angesehen, wenn der Co-Kultur-Biofilm kleiner oder gleich der Summe der Monokulturen war (Ysum ≥ Yco). Die Co-Kultur-Interaktion war stark negativ, wenn Yco kleiner als Ymin war, während eine schwach negative Beziehung festgestellt wurde, wenn Ysum ≥ Yco ≥ Ymin. Um die Wirkung extrazellulärer Metaboliten in der sozialen Interaktion zu beurteilen, wurde das Biofilm- oder Planktonwachstum in konditioniertem Medium (Yc) mit dem in unkonditioniertem Medium (Yu) verglichen25. Ein höheres Biofilm- oder Planktonwachstum im konditionierten Medium (Yc ≥ Yu) deutete auf eine positive Wechselwirkung hin. Die Wechselwirkung wurde als schwach negativ eingestuft, wenn 1 > Yc/Yu ≥ 0,5. Eine erhebliche Verringerung des Biofilm- oder Planktonwachstums (Yc/Yu < 0,5) war ein Hinweis auf starkes Negativ.

Die Gesamt-DNA von ASV2 A. ramosus, ASV1 P. fluorescens und ASV11 R. erythropolis wurde mit der Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode68 extrahiert. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde auf der Illumina NovaSeq PE150-Plattform durchgeführt. Qualitätsfilterung und Adapterentfernung wurden mit AdapterRemoval (Version 2.2.2)69 durchgeführt. Die gefilterten Lesevorgänge wurden über A5-MiSeq (Version 20160825)70 und SPAdes (Version 3.12.0)71 zusammengestellt. Die Genometwürfe wurden auf der Plattform Integrated Microbial Genomes Expert Review (IMG ER) kommentiert. Die Genomdaten sind in der IMG-Datenbank mit den IMG-Genom-IDs 2934219947, 2934206586 und 2934877363 verfügbar.

ASV1 P. fluorescens und ASV11 R. erythropolis wurden in ISEM als Monokultur und in Co-Kultur mit ASV2 A. ramosus gezüchtet. Nach 4-stündigem Wachstum wurde die Bakterienkultur in der exponentiellen Phase geerntet (ergänzende Abbildung 35). Die Gesamt-RNA wurde mit der TRIzol-Extraktionsmethode72 extrahiert. Die Paired-End-Sequenzierung wurde auf der Illumina NovaSeq PE150-Plattform durchgeführt. Htseq-count (Version 1.6.0) wurde verwendet, um die Lesezahl einzelner Gene zu generieren, und die unterschiedlich exprimierten Gene (Fold Change ≥2, p-Wert < 0,05) wurden durch DESeq2 (Version 1.28.1)73,74 identifiziert. 75. Die KEGG-Funktionsanreicherungsanalyse wurde mit ClusterProfiler (Version 4.0.0)76 durchgeführt.

Die Siderophorproduktion durch Pseudomonas- und Rhodococcus-Stämme wurde durch den CAS-Assay77,78 nachgewiesen. Bakterienzellen wurden 48 Stunden lang in ISEM kultiviert. 100 μl gefilterter Überstand wurden mit einem gleichen Volumen CAS-Assaylösung (1 mM CAS, 0,1 mM FeCl3) gemischt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang stehen gelassen und dann wurde die Absorption bei 630 nm gemessen. Enterobactin, ein bakterielles Siderophor, wurde zur Erstellung der Standardkurve verwendet (ergänzende Abbildung 36).

Die Rolle des Siderophors bei der mikrobiellen Interaktion wurde durch die Deletion des Siderophor-Synthetase-Gens (sfnaD, Locus-Tag: Ga0508010_06_50115_52037) in ASV1 P. fluorescens mittels homologer Rekombination aufgeklärt. Der mutierte Stamm wurde nach einem zuvor entwickelten Verfahren konstruiert79,80. Die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen flankierenden Regionen von sfnaD wurden mit den Primerpaaren sidupS/sidupA bzw. siddwS/siddwA amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in das Suizidplasmid pDS3.0 ligiert, um das Plasmid pDS3.0-ΔsfnaD zu erzeugen. Nach der Verifizierung des Plasmids durch Sequenzierung wurde pDS3.0-ΔsfnaD in ASV1 P. fluorescens elektroporiert und auf LB-Platten mit 30 μg/ml Gentamicin selektiert. Die Stämme mit pDS3.0-ΔsfnaD wurden dann 48 Stunden lang in LB kultiviert und dann auf LB-Platten mit 20 % Saccharose ausgebreitet, um Saccharose-positive und Gentamicin-negative Phänotypen (sfnaD-Deletionsmutante) zu screenen. Die Deletion von sfnaD wurde durch PCR-Amplifikation und -Sequenzierung verifiziert (ergänzende Abbildung 37). Die in dieser Studie verwendeten Primersätze sind in der Ergänzungstabelle 9 aufgeführt. Die Siderophorproduktion von ΔsfnaD in ISEM lag unter der Nachweisgrenze (0,045 mM), was mit der verringerten Halogröße der ΔsfnaD-Kolonie auf der CAS-Agarplatte übereinstimmt (Ergänzungsabbildung). 38).

FAD, FMN und RF wurden über hochauflösendes LC-QTOF (1260–6540, Agilent) identifiziert und quantifiziert, ausgestattet mit einer ZORBAX SB-C18-Säule (2,1 × 150 mm, 5 µm)81,82. Es wurde ein mobiler Phasengradient mit Methanol mit 0,5 % Essigsäure als mobile Phase A und 0,5 % Essigsäure (pH 4,5) als mobile Phase B verwendet. Die Bedingungen des Lösungsmittelgradienten wurden bei einer Flussrate von 0,2 ml/min wie folgt angewendet: Die mobile Phase A stieg in den ersten 7 Minuten von 7 auf 100 %, wurde bis 9 Minuten gehalten, kehrte dann nach 14 Minuten auf 7 % zurück und wurde 4 Minuten lang äquilibriert. Flavin-Standards wurden von Shyuanye Co. (China) für RF und FAD und Bidepharm Co. (China) für FMN gekauft. Um die Ausscheidung von Flavinen zu bestätigen, wurde ASV1 P. fluorescens in ISEM kultiviert und die extrazellulären Metaboliten wurden mit dem gleichen Ansatz wie für die Exometabolomanalyse extrahiert. Der LC-QTOF wurde im Positivionenmodus betrieben. Die MS-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Gastemperatur bei 350 °C, Zerstäubergas bei 40 psi, Kapillarspannung bei 4000 V und Fragmentor bei 170 V. Flavine wurden identifiziert, indem die genaue Masse und Retentionszeit authentischer Standards abgeglichen wurden (Supplementary). Abb. 39). Flavine wurden mit einem Diodenarray-Detektor bei 267 nm quantifiziert. Kalibrierungskurven wurden in dreifacher Ausfertigung erstellt (ergänzende Abbildung 40). Die Präzision und Genauigkeit der Methode wurden bei drei Konzentrationsniveaus bewertet (Ergänzungstabelle 10).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die rohen Amplikon- und Transkriptomsequenzierungsdaten sind in der NCBI SRA-Datenbank mit den Zugangsnummern PRJNA764456 und PRJNA813193 hinterlegt. Die Referenzbibliotheken zur Metabolitenidentifizierung sind erhältlich bei METLIN (http://metlin.scripps.edu), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), LipidMaps (https://www.lipidmaps.org/), und mzCloud (https://www.mzcloud.org/). Die Taxonomie-Referenz ist in der Greengenes-Datenbank verfügbar (http://greengenes.lbl.gov). Auf die KEGG-Pfade kann über die KEGG-Datenbank (https://www.genome.jp/kegg/) zugegriffen werden. Die Genomdaten für Bakterienisolate sind in der IMG-Datenbank (https://img.jgi.doe.gov/) verfügbar. Rohdaten einschließlich Metabolomics-Daten, konfokale Bilder von Biofilm während der Kolonisierung, Dynamik der Gemeinschaftszusammensetzung, erkannte Metaboliten in Metabolomics, unterschiedlich exprimierte Gene in Transkriptomdaten, Biofilmausbeute und Planktonwachstum in Monokultur und Co-Kultur, Häufigkeit verschiedener Genotypen in Co-Kultur und Konzentrationen von AAs während der Biofilmentwicklung wurden in der Figshare-Datenbank (https://figshare.com/projects/Cooperative_interactions_drive_spatial_segregation/156834) hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der für die Bildverarbeitung und Nullmodellanalyse verwendete Computercode wurde in der Figshare-Datenbank (https://figshare.com/projects/Cooperative_interactions_drive_spatial_segregation/156834) gespeichert.

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YW und PC danken für die Finanzierung durch das National Key Research Program of China (2020YFC1806802), die National Natural Science Foundation of China (42225706, 42177281, 42177283), das Royal Society Newton Advance Fellowship (NAF/R1/191017) und Fundamental Research Funds für Zentrale Universitäten (2662022ZHYJ001, 2662021JC012, 2662023PY010). CLP dankt für die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Fördervereinbarung Nr. 725613 MinOrg). KX wird vom Hundred Talents Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften finanziert. Wir danken Assoc. Prof. Yujie Xiao und Meina He für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Mutantenkonstruktion. Wir möchten uns auch bei Prof. Feng Ju und Prof. Shuo Jiao für hilfreiche Kommentare und Vorschläge bedanken.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yichao Wu, Chengxia Fu.

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Hochschule für Ressourcen und Umwelt, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China

Yichao Wu, Chengxia Fu, Chunhui Gao, Jun Liu, Qiaoyun Huang und Peng Cai

School of Earth and Environment, University of Leeds, Leeds, LS2 9JT, Großbritannien

Caroline L. Peacock & Ke-Qing Xiao

Abteilung für Mikrobiologie, Fachbereich Biologie, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Soren J. Sorensen

Abteilung für Umweltgartenbau, Royal Horticultural Society, Wisley, Surrey, GU23 6QB, Großbritannien

Marc A. Redmile-Gordon

Staatliches Schlüssellabor für Stadt- und Regionalökologie, Forschungszentrum für Öko-Umweltwissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Ke-Qing Xiao & Yongguan Zhu

Fakultät für Physik, Huazhong Universität für Wissenschaft und Technologie, Wuhan, China

Lied von Zixue Li & Peiyi

Schlüssellabor für städtische Umwelt und Gesundheit, Institut für städtische Umwelt, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Xiamen, China

Yongguan Zhu

Institut für Umweltgenomik und Abteilung für Mikrobiologie und Pflanzenbiologie, University of Oklahoma, Norman, USA

Jizhong Zhou

State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, School of Environment, Tsinghua University, Peking, China

Jizhong Zhou

Erd- und Umweltwissenschaften, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, USA

Jizhong Zhou

Fakultät für Bauingenieurwesen und Umweltwissenschaften, University of Oklahoma, Norman, USA

Jizhong Zhou

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YW und PC haben das Projekt konzipiert und gestaltet. YW und CF führten die Experimente durch und analysierten die Daten. PS und ZL stellten die mikrofluidischen Chips her. YW und CF interpretierten die Daten im Gespräch mit PC und CLPYW und CF verfassten das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren.

Korrespondenz mit Peng Cai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, Y., Fu, C., Peacock, CL et al. Kooperative mikrobielle Interaktionen fördern die räumliche Segregation in porösen Umgebungen. Nat Commun 14, 4226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39991-4

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Eingegangen: 26. Mai 2022

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 15. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39991-4

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